HPLC چیست و چگونه کار میکند

نحوه عملکرد دستگاه HPLC: شرح دقیق مکانیسم

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یکی از مهم‌ترین تکنیک‌های جداسازی و آنالیز در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و صنعتی است. این روش به دلیل دقت بالا، قابلیت جداسازی گسترده انواع ترکیبات پیچیده با سرعت عملکرد مناسب، در صنایع مختلفی از جمله داروسازی، مواد غذایی، محیط زیست و شیمیایی کاربرد فراوان دارد. HPLC مکانیزمی دقیق دارد که از اجزای مختلفی مانند PUMP, Autosampler, Manual Injector, Column و Detector تشکیل شده است و با بهره‌گیری از فشار بالا، فاز متحرک را از میان فاز ساکن عبور می‌دهد تا ترکیبات نمونه به صورت جداگانه تفکیک شوند.

در زمینه دستگاه‌های HPLC، مدل‌هایی مانند Agilent 1260 Infinity II با قابلیت‌های پیشرفته، پمپ‌های کواترنری با فشار بالا و سیستم‌ های کنترل دقیق جریان، انتخاب پرطرفداری برای آزمایشگاه‌های پیشرفته است. همچنین Waters Alliance e2695 Blue E Series به عنوان سیستمی بسیار قابل اعتماد و انعطاف‌پذیر شناخته می‌شود که با انواع دتکتور هایی مانند UV/Vis و فلورسانس یکپارچه شده و عملکرد بالا در جداسازی نمونه‌ها دارد. از سوی دیگر، دستگاه‌های سری Shimadzu Prominence-i LC-2030C 3D Plus به دلیل داشتن سیستم‌ های اتوماتیک پیشرفته، پمپ‌های فشار بالا و کنترل دمای دقیق ستون، در محیط‌هایی که نیاز به آنالیزهای سریع و دقیق دارند، بسیار مورد استقبال قرار گرفته‌اند.

1. اجزای اصلی سیستم HPLC

جزئیات بیشتر درباره اجزای سیستم HPLC

1. پمپ (Pump)
   • پمپ وظیفه ایجاد جریان مداوم و با فشار بالا برای فاز متحرک را دارد. بسته به نوع آن (isocratic یا gradient)، می‌تواند ترکیبی از چند حلال را با نسبت‌های مختلف وارد سیستم کند. در سیستم‌های حرفه‌ای‌تر، دقت پمپ‌ها در حد 0.001 mL/min است و فشار کاری می‌تواند به 600 بار یا بیشتر برسد (مانند سیستم Agilent 1290 Infinity II).
2. تزریق‌کننده نمونه (Autosampler or Manual Injector)
   • تزریق دقیق نمونه نقش کلیدی در تکرارپذیری نتایج دارد. نمونه معمولاً در حجم‌های ۵ تا ۲۰ میکرولیتر تزریق می‌شود. در اتوسمپلرها، سیستم سرمایش، کنترل حجم، و شست‌وشوی نیدل وجود دارد که مانع آلودگی بین نمونه‌ها می‌شود
3. ستون کروماتوگرافی (Column)
   • ستون مهم‌ترین جزء HPLC است که جداسازی ترکیبات در آن انجام می‌شود. بسته به کاربرد، از ستون‌هایی با فاز ساکن مختلف (مانند C18 یا سیان‌پروپیل) استفاده می‌شود. طول، قطر و اندازه ذرات داخل ستون در کارایی جداسازی مؤثر هستند.
4. دتکتور (Detector)
   • دتکتور تغییرات در ترکیب خروجی ستون را تشخیص می‌دهد. متداول‌ترین نوع آن UV-Vis است که در طول‌موج خاصی جذب نوری را اندازه‌گیری می‌کند. دتکتورهایی مانند PDA (Photodiode Array)، فلورسانس (FLD) و MS (Mass Spectrometry) نیز استفاده می‌شوند.
5. سیستم جمع‌آوری داده (Data Acquisition System)
   • نرم‌افزارهایی مانند Empower، OpenLab یا LabSolutions داده‌های خروجی را پردازش، آنالیز، و ذخیره می‌کنند و پارامترهایی مانند Area، Retention Time و Resolution را ارائه می‌دهند.

۲. فاز متحرک و ساکن: انتخاب حلال‌ها

فاز متحرک نقش مهمی در انتخاب‌پذیری (selectivity) دارد. در HPLC معکوس (RP-HPLC)، فاز ساکن غیرقطبی است (مانند C18) و فاز متحرک ترکیبی از آب و حلال‌های قطبی مانند متانول یا استونیتریل است. در HPLC نرمال (NP-HPLC)، عکس این حالت برقرار است. درصد حلال‌ها، pH، و نوع بافر تأثیر زیادی در کیفیت جداسازی دارند.

۳. مکانیسم جداسازی در HPLC

مکانیسم جداسازی در HPLC بر اساس برهم‌کنش‌های فیزیکی و شیمیایی بین مولکول‌های ترکیبات و فاز ساکن است:

• برهم‌کنش آب‌گریز (Hydrophobic Interaction): در RP-HPLC، ترکیبات آب‌گریز بیشتر جذب فاز ساکن می‌شوند و دیرتر از ستون خارج می‌گردند.
• برهم‌کنش قطبی یا یونی: در HILIC یا IC، مولکول‌ها با بار یا قطبیت متفاوت در فاز ساکن تفکیک می‌شوند.
• اندازه‌ی مولکولی: در GPC یا SEC، مولکول‌های بزرگ‌تر زودتر از ستون عبور می‌کنند.

4. سیستم‌های دتکتور در HPLC

آشکارسازها نقش مهمی در شناسایی و اندازه‌گیری ترکیبات جدا شده دارند. انواع رایج دتکتورها عبارتند از:

• UV-Vis: بر اساس جذب نور در طول موج‌های خاص
• PDA (آرایه دیودی): اندازه‌گیری طیف وسیعی از طول موج‌ها به صورت همزمان
• فلورسانس (FLD): حساسیت بالا برای ترکیبات کم‌مقدار
• طیف‌سنجی جرمی (MS): ارائه اطلاعات وزن مولکولی و ساختار ترکیبات

5. شاخص های عملکردی و پارامتر های کلیدی در HPLC

1. دقت حجم تزریق (Injection Volume Accuracy):
   این پارامتر نشان‌دهنده اختلاف بین حجم واقعی تزریق‌شده و حجمی است که توسط سیستم تنظیم شده. دقت بالا در حجم تزریق اهمیت زیادی دارد، چراکه روی مقدار واقعی ماده آنالیز شده تأثیر مستقیم دارد. مقدار قابل قبول برای این پارامتر معمولاً ±1٪ است.
2. تکرارپذیری حجم تزریق (Injection Volume Repeatability):
   بیانگر میزان تغییرات بین چندین تزریق متوالی از یک نمونه مشابه است. این پارامتر اغلب به صورت درصد انحراف معیار نسبی (RSD%) گزارش می‌شود. مقدار مناسب برای تزریق‌های ۵ میکرولیتر کمتر از ۰.۲٪ و برای ۱ میکرولیتر کمتر از ۰.۵٪ است.
3. دقت نرخ جریان (Flow Rate Accuracy):
   دقت در رساندن فاز متحرک با نرخ تنظیم‌شده. این نرخ به صورت mL/min تنظیم می‌شود و مقدار قابل قبول برای آن ±1٪ نسبت به مقدار تنظیم‌شده است (مثلاً 1.00 ± 0.01 mL/min).
4. پایداری نرخ جریان (Flow Rate Stability):
   نشان‌دهنده ثبات نرخ جریان در طول زمان و در طول آنالیز است. نوسان جریان باید بسیار کم باشد، معمولاً کمتر از ۰.۰۵ مگاپاسکال، تا از تغییرات فشار ناگهانی جلوگیری شود.
5. دقت گرادیان (Gradient Accuracy):
   در سیستم‌های HPLC با گرادیان، نسبت اختلاط دقیق حلال‌ها حیاتی است. دقت نسبت به ترکیب حلال‌ها باید در بازه ±0.5٪ نسبت به مقدار اسمی باشد، برای نسبت‌هایی مانند ۱۰٪، ۵۰٪ و ۹۰٪.
6. پایداری دمای ستون (Column Oven Stability):
   در آنالیزهایی که حساس به دما هستند، کنترل دقیق دمای ستون بسیار مهم است. نوسان دمای ستون باید کمتر از ±0.8 درجه سانتی‌گراد باشد و تغییرات لحظه‌ای آن کمتر از 0.01°C باشد.
7. حساسیت آشکارساز (Detector Sensitivity):
   پایین‌ترین غلظتی که سیستم قادر به شناسایی آن است. برای آشکارساز UV، این عدد معمولاً < 6.0×10⁻⁶ AU (Absorbance Units) برای نویز و Signal-to-Noise بالا اندازه‌گیری می‌شود.
8. دقت طول موج (Wavelength Accuracy):
   تفاوت بین طول موج واقعی و طول موج تنظیم‌شده در آشکارساز است. مقدار مجاز این اختلاف ±1.0 نانومتر است که با استفاده از محلول‌های مرجع استاندارد اندازه‌گیری می‌شود.
9. خطی بودن پاسخ آشکارساز (Linearity of Detector):
   آشکارساز باید بتواند پاسخ خطی نسبت به غلظت‌های مختلف یک ترکیب داشته باشد. این خطی بودن با ضریب تعیین (R²) یا درصد انحراف از پاسخ تئوری اندازه‌گیری می‌شود و معمولاً باید کمتر از ±5٪ انحراف داشته باشد.
10. انرژی لامپ آشکارساز (Lamp Energy):
    نشان‌دهنده سلامت و توان خروجی لامپ آشکارساز UV یا PDA است. مقدار انرژی باید بالاتر از ۷.۰ ولت در ناحیه ۲۱۰ تا ۲۴۰ نانومتر باشد تا دقت آشکارسازی حفظ شود.
11. Drift و Noise:
    Drift: تغییر تدریجی و مداوم سیگنال در طول زمان، که باید کمتر از 5.0×10⁻⁴ AU/hr باشد.
    Noise: نوسانات ناگهانی و کوچک در سیگنال که باید کمتر از 6.0×10⁻⁶ AU باشد.

در نتیجه:

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یک تکنیک حیاتی و پیشرفته آنالیزی است که به دلیل دقت، حساسیت و قابلیت جداسازی بالای خود، در علوم شیمی، داروسازی، زیست‌فناوری، محیط زیست و صنایع غذایی جایگاه ویژه‌ای دارد. این روش بر اساس جداسازی ترکیبات موجود در نمونه بر پایه تفاوت تعامل آنها با فاز ساکن و فاز متحرک کار می‌کند و با استفاده از ستون‌های تخصصی و فازهای متحرک با ترکیبات متنوع، امکان جداسازی مولکول‌های پیچیده با ساختارهای متنوع را فراهم می‌آورد.

یکی از نقاط قوت HPLC، توانایی کنترل دقیق شرایط عملیاتی شامل فشار، دما، سرعت جریان و ترکیب فاز متحرک است که باعث افزایش بازتولیدپذیری و حساسیت آنالیزها می‌شود. تجهیز دستگاه به سیستم‌های پیشرفته تزریق نمونه و آشکارسازهای متنوع نظیر UV/Vis، PDA و فلورسانس، دامنه کاربردهای HPLC را گسترش داده و امکان آنالیز دقیق ترکیبات در غلظت‌های بسیار پایین را فراهم کرده است.

از نظر عملکرد، HPLC به کمک فشار بالا و تکنولوژی‌های مدرن، جداسازی‌های سریع و با کیفیت بالا انجام می‌دهد، به طوری که نمونه‌های پیچیده زیستی و شیمیایی به راحتی قابل آنالیز هستند. همچنین، امکان تطبیق روش‌های کروماتوگرافی بر اساس نیازهای مختلف تحقیقاتی و صنعتی باعث شده این تکنیک به یکی از ابزارهای استاندارد و ضروری در آزمایشگاه‌های تحقیق و کنترل کیفیت بدل شود.

با توجه به پیشرفت‌های مداوم در طراحی ستون‌ها، آشکارسازها و سیستم‌های کنترل، HPLC همچنان به عنوان یک فناوری کلیدی در آنالیزهای مولکولی باقی می‌ماند و نقش مهمی در توسعه داروها، تضمین کیفیت مواد غذایی، پایش آلاینده‌ها و تحقیقات علمی ایفا می‌کند.

منابع

1. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L. (2012). Practical HPLC Method Development. Wiley.
2. Agilent Technologies. HPLC Fundamentals
3. Waters Corporation. Principles of HPLC
4. Shimadzu Corporation. Introduction to HPLC